微课回顾 | 新冠多重PCR Panel到底有多少重
全球新冠疫情依然严峻。在当前的背景下，智造微课推出了#战疫特别版#，有幸邀请到了近期预印在bioRxiv的文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》作者之一，为我们介绍在新冠检测中高通量检测常见的方法对比，并详细介绍了多重PCR扩增子测序的原理及优势。
新冠病毒检测方法对比
在新冠病毒检测过程中，会面临很多实际问题，例如样本组成比较复杂，样本的病毒载量较低，并且RNA病毒很容易降解等，这些都会影响检测结果的准确性，为临床诊断带来很大困扰。当前，检测方法众多，各有不同，但如何在临床检测中根据不同样本情况、条件和目的选择适合的检测方法，尚缺乏系统性的研究。
近期预印在bioRxiv的文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》对比了宏基因组测序（Meta）、探针捕获测序（Capture）和多重PCR扩增子测序（Amplicon）三种方法在新冠检测中的优劣势。可以为临床及科研工作者在选择不同检测方法时，提供参考依据。（点击“阅读原文”，获取文章全文）
文章分析了三种方法在病毒全基因组上的覆盖度均一性、富集效果、突变检测准确性以及相同检测所需要的数据量对比，并着重展示了多重 PCR在病毒检测中的各项性能指标，最后文章给出了不同情况下的选择参考指导，并指出：如果研究者只想研究目标微生物，并只关注最主要的碱基突变，且面对的样本极具挑战性（病毒载量<102copies/ml，ct值>35），推荐多重PCR扩增子测序方法。
文章中使用的多重PCR方法采用了华大智造最新推出的ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0试剂盒产品。该产品针对三个不同类型的DNA靶标进行捕获，能够准确获取样本病毒载量信息。该产品针对三个不同类型的DNA靶标进行捕获，能够准确获取样本病毒载量信息。
1
捕获已知浓度的人工合成的DNA--外参；
2
捕获病毒全长基因组DNA；
3
捕获病毒宿主-人GAPDH基因--内参。
新冠病毒多重PCR扩增子测序性能
华大智造ATOPlex平台超高重PCR扩增技术，可在单管中实现病毒全长基因组的富集，最大程度降低样本交叉污染风险，整个实验操作只需简单3步，快速便捷，结合DNBSEQ测序平台可轻松获得SARS-CoV-2病毒全基因组信息。
基于该技术开发的华大智造ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0试剂盒可用于新冠病毒的检测、鉴定以及进化研究，能够获得病毒耐药性、病毒细胞含量等生物学信息。该产品性能表现优异，结果显示比对率及特异性均大于95%，均一性也在90%以上，研究同时做了两次平行实验考察方法的稳定性，结果显示R2值为0.9798，表明两次结果无明显差异。在低病毒载量的情况下，基因组覆盖率大于99%，并且病毒基因组5'端和3'端均无明显下降。目前有两种测序类型可供选择，PE100可用于病毒鉴定和全基因组信息获取，如仅需检测病毒则可选择SE50，最低数据量仅为1M reads。
在性能测试实验中，研究人员将病毒培养提取物转换成cDNA后，进行了6个梯度的浓度测试（10X稀释），所有稀释样本掺入已知浓度人工合成DNA和人基因组DNA，然后同时进行多重PCR测序和RT-PCR。结果显示，对于10-6梯度稀释的样本，RT-PCR无法检测出，但多重PCR仍可以检出，同时与水的样本结果显著差异，这表明在极低浓度的情况下，使用多重PCR方法优于RT-PCR，并且假阳性率低。
新冠病毒多重PCR扩增子测序挑战
多重PCR方法有诸多优势，但也同样面临挑战，例如样本污染，因此在研发过程中，我们也进行了改善，相较于其他多重PCR方法，ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0试剂盒产品可实现全长基因组一管扩增，有效降低样本交叉污染；为防止气溶胶污染特别设计了污染物清除体系，有效降低气溶胶对后续PCR的影响；同时采用双唯一Barcode结合DNBSEQ测序方法避免Barcode串扰问题，降低了在大规模平行测序过程中强阳性样本对弱阳性或阴性样本的污染。基于上述技术，SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel试剂盒产品能够最大程度上避免样本污染，减少假阳性。
新冠病毒多重PCR扩增子测序整体解决方案
目前，基于华大智造ATOPlex多重PCR定制产品平台开发的ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0试剂盒产品可支持全流程自动化解决方案，从样本抽提到数据分析，最快可24小时内完成并出具检测报告。其中建库部分搭配华大智造自主研发的自动化建库仪MGISP-100或MGISP-960，可支持8-192个样本同时建库，全自动化操作避免人为干扰，有效节省宝贵时间。核心测序采用DNBSEQ平台，可提供高中低多种通量选择，检测结果更准确。
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Q1：不同CT值的样本测序数据量是一样的吗？
A1：不同CT值得到的病毒的测序深度是不一样的，但是由于是PCR方法，对病毒的靶向富集的能力很强，因此能够在5-10 Mreads的情况下在不同的CT值都能都到很好的全基因组覆盖效果。
Q2：华大智造现在的测序平台可以测两端的index吗？如果采用SE50的测序策略，怎样处理Barcode串扰？SE50+10+10，这里应该是单端测序，但是10+10指的是双Barcode吗？
DNBSEQ平台已经推出双Barcode测序，在普通的测序试剂的基础上额外够买一个Barcode引物模块就可以进行双端Barcode测序，SE50也可以进行双Barcode测序，10+10是指2个10bp Barcode测序。
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